Cos’è il metodo Sanger, la tecnica di sequenziamento del DNA uscita al test di Medicina 2019
Al test di ingresso di Medicina 2019 è stata posta una domanda sul metodo Sanger, la tecnica di sequenziamento del DNA ideata da Frederick Sanger, chimico britannico – scomparso nel 2013 – vincitore di ben due premi Nobel. Il primo lo conquistò nel 1958 per aver identificato il modo in cui si collegano le sequenze di amminoacidi nelle molecole di insulina; la seconda volta fu premiato nel 1980 proprio per aver messo a punto il raffinato metodo per sequenziare il DNA che porta il suo nome. La tecnica permette di determinare la sequenza/ordine dei nucleotidi e delle basi azotate delle molecole di DNA, ovvero Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) e Citosina ( C ). In parole semplici, al termine del sequenziamento del DNA si ottiene un lungo elenco di lettere – come ad esempio TGTACAAGTGTCTAGAAC etc etc – che definisce il genoma di un determinato organismo.
Cos'è il metodo Sanger
Il metodo Sanger, conosciuto anche come metodo a terminazione di catena o metodo dei dideossinucleotidi, è una tecnica di sequenziamento enzimatica che permette di stabilire la sequenza di nucleotidi di un frammento di DNA (acido desossiribonucleico). Sviluppata dal chimico britannico Frederick Sanger, la tecnica si basa su nucleosidi (composti chimici alla base dei nucleotidi con l'aggiunta di un gruppo fosfato) modificati in modo artificiale. Per eseguirla è necessario mettere a punto quattro provette per la reazione, che presentiamo qui di seguito in ordine casuale.
- Nella prima va inserito il frammento di DNA che si desidera sequenziare. Non deve superare una lunghezza di tot coppie di basi, deve essere denaturato (cioè a singolo filamento) e presente in più copie.
- Nella seconda va inserita una DNA polimerasi, cioè un enzima capace di sintetizzare un filamento di DNA partendo dallo “stampo” di un altro filamento di DNA, quello nella prima provetta. In questo modo si genera un filamento complementare durante il processo di replicazione.
- Nella terza si introduce un primer sintetizzato artificialmente, cioè un “innesco” composto da pochi nucleotidi che viene sfruttato per la sintesi del DNA.
- Nella quarta vanno aggiunti quattro tipi di deossinucleotidi trifosfato (dATP, dGTP, dCTP e dTTP).
Per procedere al sequenziamento del DNA, in ciascuna delle provette viene aggiunto uno specifico dideossinucleotide trifosfato (ddNTP) marcato radioattivamente o con fluorescenza, caratterizzato da uno specifico colore. Combinando il contenuto delle provette si ottiene una miscela di reazione nella quale grazie al processo di duplicazione prendono vita filamenti di DNA con specifiche caratteristiche. I frammenti di DNA ottenuti vengono analizzati attraverso una tecnica chiamata elettroforesi, durante la quale un raggio laser mette in evidenza i marcatori e i rispettivi colori; grazie ad essi è possibile stabilire (attraverso un computer) l'esatto ordine dei nucleotidi del frammento di DNA e ottenere così il sequenziamento.
